Le mécanisme de réplication est basé sur le fait que l'ADN est constitué d'une double hélice et que chaque brin est complémentaire de l'autre.
La transmission de l’information génétique se fait au moment de la mitose, mais la réplication proprement dite se fait avant.
Dans le cycle cellulaire des eucaryotes, on peut distinguer les trois phases: G1, S, et G2.
La réplication de l'ADN nucléaire a lieu lors de la phase S. Cet événement est repérable en soumettant la population de cellules (en tissus, ou en culture) à un marquage court avec de la 3H thymidine et en suivant, par autoradiographie, le devenir de ces cellules.
1) Découverte de l'ADN en tant que matériel génétique
* Expérience de Griffith (1912) puis d’Avery (1944) avec Pneumococcus
Griffith a utilisé deux souches de pneumocoques: la première souche est sauvage, ce sont des pneumocoques vivants et virulent c'est à dire qui tuent la souris. Ces pneumocoques peuvent être inactivés en les tuant par la chaleur, dans ce cas l'injection ne tue pas par la souris. La deuxième souche de pneumococces sont des mutants qui ont perdu une paroi de polysaccharides et de ce fait sont détruits par la souris, cette souche est a virulente. Si on mélange la souche inactivée par la chaleur (qui ne tue pas) à la souche avirulente (qui ne tue pas non plus) on observe la mortalité de la souris Conclusion de l'expérience: il existe un principe transformant dans la souche inactivée par la chaleur qui transforme la souche avirulente en souche virulente. Ce principe transformant provient de la souche mutante. * Avery a recherché le principe transformant. Il a séparé les différents composants de la souche inactivée et fait l'expérience précédente avec les composants de la bactérie. Il en est arrivé à la conclusion que le principe transformant est de l'ADN. Définition : la transformation d'une bactérie corespond à l'introduction d'un fragment d'ADN qui lui confère une nouvelle propriétée L'entrée d'ADN dans une cellule eucaryoteest appelé transfection simplement parce que les premier essais qui ont été effectués utilisait des virus recombinants, transfection vient d'infection. Le terme de transformation d'une cellule eucaryote était déjà utilisé, c’est la conversion de la cellule en un état de croissance non restreint en culture, ce qui ressemble ou est identique à un état tumoral. * Expérience de Hershey et Chase (1952) avec le phage T2 (un phage est un virus de bactérie). Ils ont infecté des bactéries avec des phages comportant de l'ADN marqué au 32P et des protéines marquées aus 35S. En séparant les bactéries du milieu, on s'appercoit que les bactéries sont marquées au 32P et que le 35S reste dans le milieu. L'ADN rentre dans les bactéries et non les protéines. Lorsque les phages se développent et lysent les cellules, l'ADN marqué est relargué dans le milieu. Conclusion : l'ADN assure la descendance. L'ADN est donc responsable de l'information génétique.* En 1940 Linus Pauling et Max Delbrüch proposent que la duplication des gènes implique la synthèse de molécules complémentaires Cette hypothèse a été testée par Meselson et Stahl (1958) Ils ont utilisé la technique de centrifugation isopycnique pour séparer des molécules en fonction de leurs densité, pour séparer des molécules denses, des molécules moins denses. En cultivant E. coli en présence de 15N (isotope lourd de l'azote), la totalité de l'ADN incorpore du 15N qui est plus dense que celui avec 14N. En conséquence,l'ADN est lui même plus dense. En centrifugation isopycnique sur gradient de chlorure de césium, l’ADN migre jusqu'à sa densité. On observe une bande, si on charge un mélange de deux ADN, provenant de bactéries cultivées en présence de 15N et de 14N, on obtient deux bandes. Si on transfère les bactéries ayant poussé sur 15N sur un milieu 14N, on obtient à la première génération de l'ADN qui migre à une position intermédiaire. A la deuxième génération on obtient deux bandes correspondant à la bande légère et à la bande intermédiaire. L'information génétique est donc contenue dans l'ADN et la réplication est semi-conservative. Il restait alors à montrer comment une molécule peut se répliquer. Pour ce faire il fallait avoir une idée de la structure de l'ADN. * En 1930 des physicochimistes suedois démontrent que l'ADN est un polymère de 20 Å d'épaisseur. * En 1951 Edwing Chargaff remarque que la composition en bases de l'ADN varie selon les espèces. De plus il remarque que A = T et G=C (règle de Chargaff). * En 1950 le physicien Maurice Wilkins obtient un cliché aux rayons X identique à celui d'un cristal : l'ADN a donc une structure régulière * Rosalind Franklin obtient par la suite un cliché en croix caractéristique d'une structure en forme d'hélice. Mais le diamêtre de l'hélice (20Å était trop grand pour une seule chaine). * En 1953 Francis Crick et James Watson construisent un modèle sur les données de Rosalind Franklin: Ils en concluent que l'ADN est double brin:c'est une hélice, ce qui est en accord avec les résultats de Maurice Wilkins et Rosalind Franklin, la régle de chargaff est respectée, il y a possibilité de synthèse à partir d'une molécule complémentaire ce qui est en accord avec l'hypothèse de Pauling et Delbrüch. conclusion : l'ADN est le support de l'hérédité. Explication de l'expérience de transformation de Griffith et Avery 3) Initiation de la réplication Chez les bactéries comme chez les mammifères, les fourches de réplication vont par paires et avancent le plus souvent en direction opposée pour former ce que l’on appelle l'oeil de réplication. Le démarrage de la réplication se situe au niveau d'une séquence appelé: origine de réplication. Parmi les éléments importants dans la réplication, on peut considérer les éléments en cis, ceux qui sont au niveau ou à proximité du site d’initiation et les éléments en trans qui viennent d’ailleurs dans le génome. Chez E. coli, les éléments en cis sont représentés par une séquence de 250 bp qui est appelée origine de réplication du chromosome ou ori C. Les éléments en trans sont des protéines qui se lient à cette séquence. La première est la Dna A, 10-12 Dna A reconnaîssent une séquence sur l’origine de réplication (Dna A box) et cette liaison ouvre partiellement les deux brins. Deux autres protéines Dna B et Dna C, peuvent alors se lier sur l’origine, continuer à ouvrire les deux brins et permettre à une primase d’initier la réplication en synthétisant un petit ARN qui servira d’amorce à une DNA polymérase. La réplication d’un plasmide utilise les éléments en trans produits par le chromosome. Comment délimiter l’origine de réplication sur un plasmide ? on effectue des délétions progressives in vitro, puis on transforme des bactéries. Si le plasmide se réplique c’est qu’on a toujours une origine de réplication fonctionnelle, s'il ne se propage plus, on a éliminé une séquence importante dans la réplication. On défini ainsi la séquence minimum pour que le plasmide se maintienne dans la bactérie. Il faut associer un marqueur au plasmide pour différentier les bactéries transformées des non transformées. On utilise un gène de résistance aux antibiotiques, si après transformation, les colonies bactériennes se développent sur un milieu avec antibiotique, le gène de résistance est transcrit et traduit, donc le plasmide s’est répliqué. Comme les origines de réplication sont reconnue par des protéines d'initiation. Il y a donc une certaine spécificité, par exemple, une origine de réplication de bactérie n'est pas reconnue par la protéine d'initiation d'eucaryote. Donc si on introduit un plasmide bactérien dans une cellule eucaryote, il ne se réplique pas et se perd lors des division cellulaires Chez les eucaryotes, il doit exister des séquences spécifiques pour les origines de réplication. Elles ne sont connues que chez la levure (Saccharomyces cerevisiae) chez qui il existe des équivalent des plasmides bactériens. Les origines de réplication sont appelées: séquences ARS (Autonomous Replication Sequence) . Elles font 100 bp et sont composées de copies de 11 nucléotides: (A ou T)TTTAT(A ou G)TTT(A ou R) Pour les mettre en évidence on suit le même principe que pour les origines de réplication des plasmides. On utilise une levure mutante par exemple incapable de synthétiser l'uracile. Cette levure ne peut pas pousser sur un milieu dépourvu en uracile. On transforme ces levures à l'aide d'un plasmide contenant le gène manquant (URA3) chez le mutant et un morceau d'ADN de la levure. Si la levure pousse on récupère le plasmide dans E. coli et on regarde ce qu'il y a dans le morceau d'ADN de levure, dans l'insertion. C'est un exemple de clonage par complémentation. Les unités de réplication Ils existe une seule unité de réplication chez les bactéries et plusieurs unités de réplication chez les eucaryotes. Chez les eucaryotes, s'il n'y avait qu'une seule origine de réplication par chromosome, huit heures, la durée de la phase S, serait un temps trop court. En effet, la DNA polymérase eucaryote polymérise 50 nucléotides à la seconde. 1 Chr = 150 x 106 bp (en moyenne) / 50 = 3 x 106 s = 800 heures Il y a donc au moins une centaine origines de réplication, espacées de 30000 à 300000 pb. Pour qu’il y ait synthèse d’ADN, comme la réplication est semi conservative, il faut tout d’abord séparer les deux brins. Mais la double hélice est extrêmement stable, il faut la chauffer à une température d’environ 90°C pour séparer les brins ce qui n’est pas possible sans altérer les autres composant de la cellule. Lorsqu’on rencontre un tel problème, il y a une protéine. C’est l'ADN hélicase qui se fixe sur l a protéine d'initiation. Les ADN hélicases ont besoin d’énergie pour séparer les deux brins. Elles trouvent cette énergie en métabolisant de l’ATP, ce sont donc des ATPases. Elles se déplacent le long de la chaîne d'ADN monocaténaire et déroulent la double hélice. L’ADN se retrouve sous forme simple brin. Si sur le même brin, il y a des structures autocomplémentaires, capables de s’apparier (de s’hybrider), l’ADN va former des structures doubles brins, des structures en tige et boucle (hairpin loop). Pour éviter ce problème, il y a des protéines qui stabilisent l’ADN simple brin qui sont appelées les SSB protéines pour single-strand DNA-binding (SSB) proteins ou protéines de déstabilisation de l'hélice. Les SSB protéines ne recouvrent pas les bases donc n'empêchent pas le passage des DNApolymérases. La synthèse d'ADN est due à une ADN polymérase, mais cette dernière a besoin d’une amorce. Ce n'est pas le cas des ARN polymérase. Dans la transcription, l'ARN polymérase se fixe sur l'ADN sur un site qui dans ce cas est appelé promoteur, elle ne nécessite pas d'amorce. Un moyen de fabriquer une amorce est donc d’utiliser une RNA polymérase. De même dans la fourche de réplication, il existe une ARN primase qui catalyse de courtes amorces d'ARN (primer en anglais = amorce). Cette amorce est d’environ 10 nucléotides.A ce niveau, tout est prêt pour synthétiser l’ADN. Cette synthèse est due à une DNA polymérase qui catalyse le formation de liaisons entre le groupement OH en 3' du désoxyribose de l’amorce ou la chaîne en élongation et le phosphate a fixé sur le carbone 5' du dNTP. Il y a libération d'un pyrophosphate PPi qui est immédiatement hydrolysé (la polymérase ne peut donc pas désassembler et reformer dNTP). La polymérisation est donc unidirectionnelle (sens 5' vers 3'). La polymérase doit donner lieu à une réplication très fidèle (une erreur pour 109 copies de paires de base). Cette fidélité est assurer par le fait que la polymérisation nécessite une amorce. La polymérase ne peut pas assembler des dNTP si le dernier nucléotide à l’extrémité 3'-OH n’est pas apparié. En cas d’erreur, la polymérisation est bloquée, jusqu’à ce qu’une DNAse enlève le nucléotide non apparié. Ces DNAses qui digèrent l’ADN à partir de l’extrémité sont appelées des exonucléases. Cette activité exonucléase est portée par la polymérase, comme l’activité 3'5' exonucléase est plus faible que l’activité polymérase, la polymérisation l’emporte si il n’y a pas d’erreur. Par contre si la polymérisation est bloquée par une erreur, l’activité exonucléase l’emporte. C'est le premier mécanisme de correction pendant la réplication Cette action de correction explique le sens de la polymérisation de 5' vers 3'. L’énergie est donnée par les nucléotides triphosphates, dans l’autres sens de 3’ vers 5’, l’énergie serait donnée par le dernier nucléotide en 5’ de la chaîne en cours d’élongation. En cas d’erreur, l’excision du dernier nucléotide incorporé libérerait un 5’ monophosphate, et il n’y aurait plus d’énergie disponible pour continuer la polymérisation.. La polymérisation est très rapide (500 nucléotides/sec chez les bactéries - 50 nucl./s chez les mammifères). Les eucaryotes n'ont pas à répliquer que leur ADN mais aussi à synthétiser les protéines qui lui sont associées. Chez les eucaryotes, il y a aussi assemblage des protéines chromosomiques pour former la chromatine ce qui explique pourquoi la fourche progresse à 50 nucléotides par seconde. Les ADN polymérases, le primosome (primase et hélicase) et les SSB protéines forment une seule grande unité qui se déplace le long de l'ADN, permettant la synthèse de l'ADN sur les deux branches de la fourche d'une façon coordonnée et efficace. 4) L'élongation On appelle fourche de réplication l'endroit où les deux brins parentaux se séparent. Du fait que la polymérisatrion s'effectue dans le sens 5'>3', elle est asymétrique. On distingue la chaîne précoce ou brin principal de la chaîne tardive ou brin secondaire. Dans la chaîne précoce, le brin 5' vers 3' est polymérisé de façon continue, il n’y a pas de de problème, par contre la polymérisation de la chaine tardive est discontinue, il y a formation de fragments d'Okasaki (nom du biochimiste). La polymérisation de la chaîne tardive requiert plusieurs enzymes : - une DNA polymérase (différente de la DNA polymérase agissant sur le brin précoce) - une RNAse H ou une activité exonucléase Les brins d'ARN provenant de la primase sont enlevés soit par une activité 5'3' exonucléase de la polymérase soit par une RNAse (dans ce cas il s'agit d'une RNAse H) qui est capable de dégrader l'ARN lorsqu'il est hybridé à de l'ADN. - une ADN ligase pour liguer le fragment néosynthétisé et le fragment précédent. La topoïsomérase I Elle empêchent l'ADN de s'emmêler au cours de la réplication. Pour que la fourche avance, il faudrait ou bien dérouler la double hélice à la vitesse de la polymérase (500 nucléotides/sec chez les bactéries comme il y a 10 nucléotides par tour d’hélice, il faudrait faire 50 tours par seconde) mais ceci nécessiterait beaucoup trop d'énergie), ou bien faire une coupure transitoire d'un brin juste en aval de la fourche pour relacher de la tension. Dans ce cas, les 2 morceaux du brin, de part et d'autre de la coupure, pivotent librement l'un par rapport à l'autre. Ensuite une soudure doit avoir lieu avant la dissociation des deux brins dans la fourche de réplication. C'est le travail de la topoisomérase I qui fait unecoupure moncaténaire. Dans le site actif de cette enzyme, il y a une tyrosine qui se lie de façon covalente avec un phosphate de l'ADN et de ce fait romps la liaison phosphodiester. Elle retient l'énergie de cette liaison de sorte que la réaction réversible de soudure ne demande pas d'énergie. Réplication et transcription Qu'arrive t-il lorsque la polymérase rencontre un ARN polymérase engagée dans la transcription d'un gène ? Une fourche de réplication avance environ 10 fois plus vite que la RNA polymérase. Si elles vont dans le même sens soit la DNA polymérase attend soit elle déplace la RNA polymérase arrêtant la transcription du même coup. Si elles vont dans des sens opposés le conflit est plus sérieux et il semble qu'il n'ait pas été bien résolu au moins chez E. coli. Le génome des bactéries est répliqué à partir d'une seule origine et la réplication est bidirectionnelle. Presque tout les transcrits sont dans le sens de la fourche de réplication, toute les exceptions comprennent des transcrits rares et courts. 5) Fin de la réplication Il existe des endroits dans les génomes ou la réplication est ralentie, Ces ralentissement ont pour but de gérer les conflits entre la réplication et la transcription. D’autre part ces endroits sont souvent des sites préférentiels de recombinaison. Chez les bactéries, pour le chromosome comme pour les plasmides, la réplication s'arrête à un endroit situé à l'opposé de l'origine. Deux régions ont été identifiées sur le chromosome d’E. coli, terD, terA et terC, terB situé à environ 100 bp de chaque coté du point de rencontre. Elles marchent chacune dans un seul sens. Cet arrangement constitue une sorte de piège, si un fourche est retardée, elle est bloquée par ces séquences de terminaison. De nombreux génomes sont linéaires et en particulier le génome des cellules eucaryotes. Comment la réplication se termine au bout du chromosome, comment s'initie la réplication sur le brin tardif pour se faire jusqu'au bout ? Le brin tardif a besoin d'une amorce fabriquée par l'ARN primase. Cette amorce a elle même besoin d'une matrice. Au bout du chromosome il y aurait à chaque génération une perte de quelques nucléotides Quatre solutions différentes ont été adoptées pour résoudre ce problème. 1- Convertir l'ADN linéaire en une molécule circulaire. C'est le cas du phage l 2 - Au lieu d'être bien défini, l'extrémité du génome est variable, composées d'unité répétées d’une dizaine de bases, ajoutées par une télomérase qui rajoute des courtes séquences en 3'. C'est le cas adopté par les chromosomes eucaryotes. La réplication ne s’effectue pas jusqu’au bout mais ces répétitions n’ont pas d’importance, ne sont pas codantes, et sont rajoutées par la suite par la télomérase. 3- L'ADN peut former une structure inhabituelle, une boucle (hairpin) au bout reliant les derniers nucléotides si bien qu'il n'y a en fait pas de bout. C'est le cas par exemple du génome mitochondrial des paramécies (qui est linéaire) 4 - Une protéine est liée à l'extrémité du génome et rend possible l'initiation au dernier nucléotide. Ce cas a été trouvé chez le phage f29 ou l'adenovirus. Il y a aussi un problème avec les génomes circulaires, il faut séparer les deux ADN qui se retrouvent enlacés comme des anneaux. La topoïsomérase II fait une coupure bicaténaire . 6) Les corrections et la réparation de l'ADN Comment l'information génétique se transmet elle fidèlement? Comment y a til les quelques erreurs qui permettent l'évolution? Correction des épreuves. En plus de la première correction due à l’activité exonucléasique 3’5’de l’ADN polymérase, il existe une deuxième correction dite la correction sur épreuve. En effet, il reste des erreurs qui sont corrigées après la polymérisation Le système de correction des épreuves reconnaît une protubérance sur les brins d'ADN et est due à des endonucléases. La correction ne doit pas être faite sur le brin matrice, mais uniquement sur le brin en cours de polymérisation. Chez E. coli, il y a méthylation de tous les résidus A des séquences GATC. Cette méthylation n'a pas lieu immédiatement de sorte que le brin qui vient d'être synthétisé et qui doit être corrigé, est reconnu parce qu'il n'est pas méthylé. Il peut y avoir aussi des modifications de l'ADN après la réplication. le taux de ces modifications peut être augmenté par des agents qui sont alors appelés mutagènes. En effet si elles ne sont pas réparées ces modifications entraînent des mutations. 7) Une réplication particulière : le rolling circle Ce mode de réplication existe par exemple chez le phage l et le phage M13 La réplication d'un seul brin est utilisée pour générer des copies de certaines molécules circulaires. Un nick ouvre un brin ce qui produit une extrémité 3'OH. La polymérisation commence à cette extrémité 3' et le nouveau brin déplace le brin parental. Cette réplication est appelée "rolling circle" parce que la polymérisation peut se dérouler indéfiniment en tournant autour du brin matrice. La forme linéaire peut être soit maintenue sous forme simple brin (cas de M13) soit convertie en double brin par la synthèse du brin complémentaire (comme dans le phage l par exemple) exemple du phage M13 C'est un bactériophage de 6.4 kb, ADN simple brin, qui contient une dizaine de gènes. Il infecte seulement les bactéries qui expriment le pilus sexuel codé par le facteur F, il pénètre par le pilus, la capside est retirée et l'ADN est transféré dans le corps principal de la bactérie. Ce brin d'ADN (appelé brin +) est alors converti en double brin circulaire appelé RF DNA (forme replicative). Cette conversion est due à des enzymes bactériens, une RNA polymérase initie la réplication qui est effectuée par une DNA polymérase. La transcription des gènes viraux peut alors avoir lieu. La protéine produit du gène II introduit un nick à un site spécifique du brin +, plus il y a de formes réplicative, plus il y a de protéine produit du gène II, si bien qu'à partir d'une certaine quantité de plasmide, ils sont tous ouverts. Une DNA polymérase ajoute des nucléotides en 3' en déplaçant le brin + originel. Une fois qu'un tour a été fait, le produit du gène II coupe au même endroit, libérant un brin linéaire qui est alors recircularisé. Au début de l'infection ce brin est de nouveau transformé en forme réplicative mais lorsqu'il y a beaucoup de forme réplicative, le produit du gène V (SSB single strand binding protein) s'accumule. Il y a production presque uniquement de forme simple brin. La balance entre les deux formes, double brin et simple brin dépend donc de la concentration en ADN double brin du phage, qui par transcription produit la protéine II responsable du nick à l'origine de la réplication en rolling circle et produit les SSB protéines qui stabilisent le simple brin empêchant la synthèse du brin complémentaire. Le DNA n'est pas encapsidé dans une structure préformée comme les autres bactériophages. Ils sont simplement couverts des protéines de la capside lorsqu'il sort de la bactérie. Ceci implique qu'il n'y a pas de limitation dans la taille de l'ADN simple brin. Il n'y a pas de lyse de la bactérie si bien qu'elle continue à pousser (plus doucement) en produisant des phages qui atteigne le nombre de 1012 par ml de culture. Le phage l C'est un virus à ADN double brin, linéaire de 50 kb avec à ses deux extrémités 12 nucléotides simple brin complémentaires (extrémité cohésives ou cos). Il se fixe sur le récepteur lamB qui permet l'absorption de maltose par la bactérie, seul l'ADN rentre dans la bactérie. A l'entrée dans la bactérie, les extrémités cohésives s'hybrident et l'ADN est ligé par une ligase d' E. coli. Là, il y a deux possibilités soit un cycle lysogénique avec intégration de l'ADN du phage dans le génome soit un cycle lytique.. Il y a tout d'abord réplication bidirectionnelle (forme q) ce qui augmente la quantité de DNA dans la bactérie puis la réplication devient unidirectionnelle (rolling circle) produisant un ADN linéaire ou les phages se suivent. L'ADN linéaire est empaqueté dans la tête du phage et est coupé au niveau des extrémités cos. Ensuite la queue du phage est assemblée. injection dans la bactérie circularisation Ce mode de réplication est utilisé pour les ADN circulaire comme par exemple les phages. Mais il est aussi utilisé dans les génomes eucaryotes comme par exemple pour amplifier l'ADN ribosomique de l'ovocyte du xénope, les gènes codant pour l'ARN ribosomique sont organisés en répétitions. Une unité est convertie en rolling circle, le brin néoformé est converti en double brin et les deux extrémités sont jointes pour générer un grand cercle d'ADN amplifié. 8) Régulation de la réplication. Exemple de la régulation du nombre de copies de plasmides Cette régulation est liée au phénomène d'incompatibilité. Certains plasmides sont incapables de coexister dans une bactérie, on dit qu'ils appartiennent au même groupe de compatibilité. Le contrôle du nombre de copies est due à la synthèse d'un répresseur qui mesure la concentration d'origine de réplication. Le système d'incompatibilité le mieux connu est celui du plasmide ColE1, qui est maintenu au niveau de 20 copies par cellules chez E. Coli. La réplication démarre avec la transcription d'un ARN qui démarre à 555 bp en amont de l'origine de réplication et la transcription continue à travers l'origine de réplication. Une RNAse coupe le transcript à l'origine libérant une extrémité 3' libre hybridée à l'ADN. Cette extrémité 3' est utilisée par l'ADN polymérase comme amorce. Le système de régulation implique une hybridation ARN/ARN. L'ARN est une molécule de 108 bases codée par le brin complémentaire de l'ARN servant d'amorce. L'hybridation de cet ARN avec l'ARN amorce inhibe la coupure par la RNAse H vraissemblablement en changeant la structure secondaire de l'ARN amorce. Comme le petit ARN agit sur tout les plasmides, il régule la quantité de plasmide présent dans la bactérie. On considère ici que le grand ARN est un régulateur positif et le petit un régulateur négatif comme dans le cas de l'atténuation de la transcription. De plus le système de régulation implique une protéine. L'hybridation des deux ARN est influencée par une protéine, la protéine Rom. Cette protéine favorise l'hybridation des deux ARN et donc régule négativement la réplication .
